細胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶，廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運動的肌肉中含量zui為豐富。細胞色素C 位于線粒體的蛋白質—脂質絡合物中，分子量約為13000，肽鏈中含有19個賴氨酸殘基，為一堿性蛋白, 等電點（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉，它是一種陽離子交換劑，細胞色素C分子剛好進入它的表面空隙。在pH7.5時細胞色素C 呈正電荷，它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換，從而被沸石吸附。裝入層析柱后，用25%硫酸銨洗脫，又可將細胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細胞色素C 純度，主要為去除雜蛋白。另外三氯乙酸可引起細胞色素C 變性和聚合，必須嚴格控制三氯乙酸用量。

 

　　細胞色素C與材料試劑

 

　　1、 設備：組織搗碎機、酸度計、離心機、分光光度計、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。

 

　　2、 儀器：剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。

 

　　3、 試劑：聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、三氯乙酸、人造沸石、氯化鋇、氯化鈉、氫氧化銨。

 

　　4、 材料：新鮮豬心（2個）。

 

　　細胞色素C實驗步驟

 

　　1、預處理：健康豬心去脂肪等結締組織—→剪碎放入碎冰中（保護酶的活性，避免搗碎機破碎時使酶失活）—→放入生理鹽水中清洗去污—→稱重：燒杯80g ，燒杯＋豬心=240g，（240-80）×1.5=240ml酸化水—→組織搗碎機勻漿10min （勻漿3min ，停5min ，為了保證搗碎機安全）

 

　　2、提取：攪拌后靜置2h —→四層紗布過濾后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在過濾后靜置2h —→放入冰箱保存過夜—→從冰箱中取出—→加2mol/L氨水調PH 至6.0，靜置30min ，過濾—→濾液加2mol/L氨水調PH 至7.5，靜置30min, 過濾

 

　　3、吸附：加10%人造沸石（濾液為220ml ）—→磁力攪拌器攪拌吸附1h —→蒸餾水洗3次—→0.2%NaCI 溶液洗3次—→濾出人造沸石待用

 

　　4、洗脫：在柱中裝人造沸石體積的三分之二蒸餾水—→將沸石放入柱中—→裝滿25%硫酸銨溶液進行洗脫，流速控制在2ml/min 以下, 收集紅色的洗脫液（沒分辨出紅色液體階段，收集了所有洗脫液）

 

　　5、鹽析：在洗脫液（300ml ）中慢慢加入固體硫酸銨75g, 邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液的濃度為50%—→置4℃冰箱過夜—→過濾，收集濾液—→向過濾液中按22ml/L的量滴加濃度為20%的三氯乙酸溶液（過濾液和20%三氯乙酸溶液在4℃遇冷, 邊加邊攪拌, 加時要快, 防止局部蛋白質變性）—→加完后分成8管，立即離心—→無明顯沉淀，再5000轉離心15min —→無明顯沉淀，向每只離心管加入2滴濃度為20%的三氯乙酸溶液—→再5000轉離心15min —→無明顯沉淀，實驗結束

 

　　6、透析 將上述溶解后的細胞色素C 裝入透析袋中, 放進500ml 燒杯中（用磁力攪拌器攪拌），用去離子水透析, 除去硫酸根離子，15min 換水一次，換手3~4次后，檢查硫酸根離子是否已被除盡。檢查方法：取2ml 氯化鋇溶液加入試管中，滴加2~3滴透析外液至試管中，若出現(xiàn)白色沉淀，表示硫酸根離子未除盡，如果不出現(xiàn)沉淀，表示透析*。將透析液過濾， 收集濾液即為細胞色素C 粗品。 記錄此粗品的體積。

 

　　實驗目的：

 

　　1、通過細胞色素C的制備，了解制備蛋白質制品的一般原理和步驟

 

　　2、掌握制備細胞色素C的操作技術及含量的測定方法

 

　　實驗原理：

 

　　細胞色素是一類含有鐵啉基團的電子傳遞蛋白，只存在于需氧細胞中。細胞色素在線粒體內(nèi)膜上起傳遞電子的作用。細胞色素C是細胞色素一種。它在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素B和細胞色素氧化酶之間，是呼吸鏈的一個重要組成部分。每分子細胞色素C含有一個血紅素和一條多肽鏈。現(xiàn)已從許多來源獲得細胞色素C結晶，并已對100多種細胞色素C蛋白的一級結構進行了測定。

 

　　結果表明，細胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。

 

　　細胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2，100℃加熱3分鐘，細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的，因為比較穩(wěn)定并易于保存。

 

　　細胞色素C 是以一種鐵卟啉為輔基的呼吸酶，廣泛存在于所有的需氧組織中。在心肌與其他做劇烈運動的肌肉中含量zui為豐富。細胞色素C 位于線粒體的蛋白質—脂質絡合物中，分子量約為13000，肽鏈中含有19個賴氨酸殘基，為一堿性蛋白, 等電點（10.5~10.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石為鋁酸鈉，它是一種陽離子交換劑，細胞色素C 分子剛好進入它的表面空隙。在pH7.5時細胞色素C 呈正電荷，它可與沸石分子上的鈉離子發(fā)生交換，從而被沸石吸附。裝入層析柱后，用25%硫酸銨洗脫，又可將細胞色素C 交換下來。硫酸銨主要是降低沸石對細胞色素C 的親和力。硫酸銨鹽析可明顯提高細胞色素C 純度，主要為去除雜蛋白。另外乙酸可引起細胞色素C 變性和聚合，必須嚴格控制酸用量。

 

　　細胞色素C與材料試劑

 

　　1、 設備：組織搗碎機、酸度計、離心機、分光光度計、層析柱、透析袋、磁力攪拌器、冰箱。

 

　　2、 儀器：剪刀、燒杯、漏斗、濾紙、天平、玻璃棒、紗布、試管、膠頭滴管。

 

　　3、 試劑：聯(lián)二亞硫酸鈉、硫酸、硫酸銨、、人造沸石、氫氧化銨。

 

　　4、 材料：新鮮豬心（2個）。

 

　　結果表明，細胞色素C的氨基酸殘基的數(shù)目在103~113之間；不同來源細胞色素C的的氨基酸殘基的順序及含量都有一定的差異。細胞色素C中賴氨酸含量較高，等電點為10.7，含鐵量為0.38%~0.43%，Mr為12000~13000，豬心細胞色素C分子量12200。細胞色素C是一種穩(wěn)定的可溶性蛋白，它易溶于水及酸性溶液，故常用酸性水提取。細胞色素C分為氧化型和還原型兩種，氧化型水溶液呈深紅色，還原型水溶液呈桃紅色。細胞色素C對熱比較穩(wěn)定，不易變性。pH 7.2~10.2, 100℃加熱3分鐘，細胞色素C氧化型和還原型變性程度均為18%~28%，若增加加熱時間，氧化型的不可逆變性程度比還原型的為高。細胞色素C對酸堿也較穩(wěn)定，可抵抗0 .3mol/L氫氧化鉀溶液的長時間處理。一般都將細胞色素C制成還原型的，因為比較穩(wěn)定并易于保存。

 

　　細胞色素C不是根據(jù)輔基來命名；與其他三類細胞色素非共價結合血紅素不同的是，細胞色素c通過分子中的半胱氨酸巰基與血紅素共價結合。細胞色素e尚無，但有細胞色素f（細胞色素c中的一種）。[3]此外，細胞色素d僅存在于細菌中。